Freqüência da deficiência na adesão leucocitária bovina

FREQÜÊNCIA DA DEFICIÊNCIA NA ADESÃO LEUCOCITÁRIA EM UMA POPULAÇÃO DE BOVINOS DA RAÇA HOLANDESA, NO URUGUAI.

(FREQUENCY OF LEUKOCYTE ADHESION DEFICIENCY IN A POPULATION OF HOLSTEIN-FRIESIAN CATTLE IN URUGUAY)

S. LLAMBÍ1, K. GUEVARA2, G. RINCÓN3,  R. ZAFFARONI4, E. DE TORRES5, J. BARRERA6, MA. V. ARRUGA7, V. RODRÍGUEZ8,  & A. POSTIGLIONI9

 

ARS VETERINARIA, Jaboticabal, SP, Vol. 19, nº 1, 052-056, 2003. ISSN 0102-6380

 

1 Professor Adjunto. Msc. PhD. Área Genética. Fac. Veterinaria. UDELAR. Lasplaces 1550, Montevideo, Uruguay. E-mail: [email protected] 2 Pesquisador. Dr en Veterinaria.Área Genética. Fac. Veterinaria. UDELAR. 3 Professor Assistente. Dr. en Veterinaria. Área Genética. Fac. Veterinaria. UDELAR. 4 Aluno de grado. Área Bioestadística. Fac. Veterinaria. UDELAR. 5 Dr. en Veterinaria. Aluno da pós-graduação. Área Bovinos de Leche.  Fac. Veterinaria. UDELAR. 6 Professor Assistente. Área Genética. Regional Norte. Fac. Veterinaria, UDELAR. 7 Professor Titular. PhD. Lab. Citogenética y Genética Molecular. Fac. Veterinaria. UNIZAR-España. 8 Licenciada en Genética. Aluno da pós-graduação. Área Genética. FMRP-USP 9 Professor Agregado. PhD. Área Genética. Fac. Veterinaria. UDELAR.

 

RESUMO                                                                                         

A enfermidade hereditária Deficiência na Adesão Leucocitária Bovina (BLAD) é autossômica recessiva, na qual os terneiros homozigotos apresentam uma expectativa de vida entre 2 e 8 meses. Os aspectos moleculares desta enfermidade implicam a presença de uma mutação pontual no complexo CD11/CD18 (A/G). No presente trabalho utiliza-se a técnica de PCR/RFLP (Taq I) com oligonucleotídios específicos para amplificar a região do gene CD18, onde se localiza a mutação pontual (Alelo TL, bandas de 109 pb e 50 pb; alelo BL, banda de 159 pb). Estudou-se uma amostra de bovinos da raça Holandesa (n=138) provenientes de 15 estabelecimentos leiteiros no Uruguai, dividida em dois grupos: I, com 121 fêmeas; II, com 17 machos (16 machos nacionais e 1 macho  importado). Analisou-se a progênie (n= 11) de um dos machos portadores de BLAD acasalado com distintas fêmeas. No grupo I, obteve-se uma freqüência de portadores de BLAD de 6,6% e, no grupo II, de 11,8%. Na progênie do touro heterozigoto foram observados 45,5% de animais portadores. Determinou-se a freqüência gênica tendo em conta o efeito da seleção na presença de um gene letal recessivo, obtendo-se q=0,029. A identificação por técnicas moleculares de animais portadores de BLAD permite diminuir o índice de mortalidade em terneiros, a qual é decorrente dessa imunodeficiência de origem genética.

PALAVRAS-CHAVE: Bovinos. Enfermidade hereditária BLAD. Diagnóstico. PCR-RFLP.

SUMMARY

The Bovine Leukocyte Adhesion Deficiency (BLAD) is a hereditary disease with an autossomal recessive mode. The homozygous calves have a life expectancy of 2 to 8 months. The molecular aspects of the disease implied that affected animals present a single point mutation in the CD11/CD18 complex (A/G).  The study was performed using the PCR/RFLP (Taq I) technique with specific primers that amplify the CD18 region where the mutation point is located (allele TL, bands of 109bp and 50bp; allele BL band of 159bp). The 138 samples used were drawn from different dairy farms in Uruguay, divided into two groups I (121 cows), and II (17 bulls). The progenies (n=11) of one of the BLAD carrier bulls were

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S. LLAMBÍ, K. GUEVARA, G. RINCÓN, R. ZAFFARONI, E. DE TORRES, J. BARRERA, M. V. ARRUGA, V. RODRÍGUEZ, A. POSTIGLIONI. Freqüência da deficiência na adesão leucocitária em uma população de bovinos da raça Holandesa, no Uruguai. / Frequency of leukocyte adhesion deficiency in a population of holstein-friesian cattle in Uruguay. Ars Veterinaria, Jaboticabal, SP, Vol. 19, nº 1, 052-056, 2003.

analyzed mating the bull with cows at random. In group I BLAD carrier frequency was 6.6%, while in group II  the frequency was 11.8%.  The progeny of a heterozygous bull showed 45.5% carrier frequency. In this case BLAD gene frequency was calculated as q=0.029. The identification of BLAD carriers using molecular techniques would help to reduce the mortality of calves due to this genetic immunodeficiency disease.

KEY-WORDS: Cattle. Hereditary BLAD disease. Diagnosis, PCR-RFLP

INTRODUÇÃO

A Deficiência na Adesão Leucocitária Bovina hereditária (BLAD) foi descrita em 1983 na raça Holandesa, sendo determinada como uma enfermidade autossômica recessiva (Hagemoser et al., 1986). Em humanos e em cães foi descrita uma granulocitopatia hereditária similar, na qual se identifica  uma mutação pontual no gene que codifica a subunidade ß2 integrante do complexo glicoprotéico leucocitário (Renshaw e Davis, 1979 e Gerardi, 1996). Shuster et al. (1992), seqüenciaram em bovinos o gene CD18 o qual codifica uma subunidade protéica que integra o complexo maior ß2, integrante dos neutrófilos. Esta família de glicoproteínas atua como moléculas de adesão leucocitária, permitindo a agem dos leucócitos do sangue aos sítios de infecção. Os pesquisadores referidos identificaram uma mutação pontual (A/G) no quarto exon, com a substituição do aminoácido Ac. Aspártico por Glicina na posição 128, (D128G). As células leucocitárias (neutrófilos) dos bovinos homozigotos para o alelo recessivo (D128G) do gene CD18 não podem realizar a migração e a fagocitose em conseqüência de infecções bacterianas recorrentes, ocorrendo morte prematura dos terneiros após 2 a 8 meses (Gerardi, 1996). Kehrli et al. (1992) desenvolveram um método de diagnóstico que utiliza a técnica de PCR-RFLP para identificar o polimorfismo, detectando animais portadores de BLAD. Mediante análises de “pedigree” baseadas nas técnicas de DNA, determinou-se a origem da mutação num reprodutor com alto Índice Total de Produção (TPI), de modo que a utilização deste touro e sua descendência portadora permitiram uma ampla difusão do BLAD em nível mundial. Powell e Norman (1995) reportam que 24% dos reprodutores pertencentes a Centros de IA dos USA apresentam genótipo heterozigoto para o gene CD18, sendo, portanto, portadores de BLAD. Este gene localiza-se no cromossomo 1 de bovinos (BTA1), no qual estão identificados e localizados outros loci de importância econômica (ETL) e de características quantitativas (QTL) como: gene polled, dois genes QTL ( relacionados com a produção leiteira), o gene  PIS  (síndrome intersexo caprino), o gene DUMPs (enfermidade por deficiência da uridina monofosfato sintase), fator de transcrição pituitária-específico (PIT1) (Womack, 1996; Vaiman et al., 1997 e

Schmutz et al., 1998). A Associação do gado Holstein dos Estados Unidos publica mensalmente uma lista com os 100 touros de maior TPI, identificando os portadores de BLAD com as letra BL e os livres, com as letras TL. Nessa lista há um grande número de animais sem identificação (Tabela 1). A Holandesa é a principal raça leiteira no Uruguai e desde 1971 tem tido grande expansão com a importação de sêmen congelado dos Estados Unidos (74.1%) e Canadá (24.3%) (Kelly, 1993). O objetivo do presente trabalho é a identificação da presença de animais portadores da enfermidade nessa população, calculando a freqüência do alelo mutante BL mediante a técnica molecular de  PCR/ RFLP em uma  amostra de animais.

MATERIAL  E  MÉTODOS

Foram analisados 138 bovinos da raça Holandesa, procedentes de 15 estabelecimentos localizados na zona leiteira Sul e no Departamento de Salto, Uruguai, sendo 121 fêmeas (104 vacas adultas tomadas ao acaso e 17 terneiras) e 17 machos (16 nacionais e 1 importado). A extração de DNA foi realizada nas fêmeas e nos terneiros a partir de sangue total, utilizando o protocolo padrão com fenol/clorofórmio (John et al., 1991). Nos touros a extração do DNA foi feita a partir de sêmen, utilizando a técnica de extração com proteinase K e dithiothreitol/fenol/clorofórmio  (Schlieben et al., 1991). Para a amplificação da seqüência do gene CD18 (159 pares de bases), usou-se a técnica de PCR (buffer PCR 1x, dNTP 0.2 mM, MgCl2 1.5 mM) com oligonucleotídios específicos de 21 mer  (0.2 ìM) identificados como Blad1 5’AGGCAGTTGCGTTCAACGTGA3′ e Blad2 5’CCGACTCGGTGATGCCATTGA3′. As reações foram feitas em um  termociclador  “Thermolyne” com um programa de : 95ºC-5’/62ºC-1’/73ºC-1′ (1 ciclo), 95ºC-1’/62ºC1’/73ºC-1 (28 ciclos), 95ºC-1’/62ºC-1’/73ºC-5′ (1 ciclo). Fez-se restrição enzimática  com 15 ìl de produto de PCR e 5 unidades de endonuclease Taq I, 2 horas a 65ºC (Mirck et al., 1995). Os produtos de amplificação e os RFLPs correspondentes foram analisados  em géis de agarose 4% corados com brometo de etídio.

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Foram calculadas as freqüências gênicas na amostra estudada em um estabelecimento leiteiro em que se utilizava como reprodutor um touro portador de BLAD. A análise baseou-se na suposição de equilíbrio gênico de Hardy-Weinberg,  considerando o efeito da seleção contra um gene recessivo letal (Falconer, 1986).

RESULTADOS  E  DISCUSSÃO

Nas duas amostras analisadas (I, II) detectou-se a presença do alelo mutante BL, não se encontrando animais homozigotos recessivos (BL/BL). Apresentam-se os genótipos e a porcentagem de portadores  por categoria na Tabela 2. Os animais heterozigotos apresentaram o alelo TL, fragmentos 109pb e 50pb e o alelo BL, fragmento 159pb,  (Figura 1). Na Argentina a freqüência de touros Holandeses pertencentes a centros de I.A. portadores do alelo BL foi estabelecida em 2,88% e em 1,79% para vacas (Poli et al., 1996). Recentemente Janosa et al. (1999) compararam a produção leiteira da progênie de touros portadores de BLAD com touros normais (TL/TL), encontrando diferenças significativas a favor destes últimos.  Esses resultados basearam-se na análise da progênie de 9 touros portadores comparados a 77 touros sadios, de acordo com a classificação TPI de novembro de 1997 (Tabela 2). Esses autores demonstraram a importância da determinação dos portadores e a realização de um plano adequado de acasalamento, dentro de um programa de eliminação do BLAD.

Vaiman et al. (1997) descreveram no mapa do BTA1 a presença de dois QTLs relacionados à produção leiteira. Estes genes encontram-se ligados ao gene CD18 e poderiam estar associados à diminuição da produção leiteira observada por Janosa et al. (1996)  na progênie de touros portadores de BLAD. Morin et al. (1976) estimam que a taxa mundial de mortalidade em terneiros Holandeses no nascimento é de 7,7% e em 36% dos casos o agente etiológico é desconhecido. Ao encontrar animais portadores em nossos rebanhos, devemos considerar a influência da enfermidade na taxa de mortalidade de terneiros e sua repercussão na produção leiteira. A freqüência do alelo BL em nossa amostra populacional foi de q=0,029. Ao analisar a freqüência gênica em um estabelecimento onde se utilizava como reprodutor um touro portador, observou-se uma freqüência q=0,05, configurando uma herança Mendeliana monofatorial com 45,5% de portadores na progênie. A freqüência observada na população estudada é menor que a observada nos Estados Unidos, estimada em q=0,065. No Japão a freqüência do alelo BL é estimada em q=0,058 em 10 rodeios e q=0,041 em 20 rodeios analisados (Womack, 1992 e Nagahata et al., 1997). Considerandose nosso resultado (q=0,05) e utilizando-se  os métodos tradicionais de seleção, para reduzir à metade a freqüência do gene, levaríamos 90 anos, considerando um intervalo de gerações de 4,5 anos (Cardelino e Rovira, 1987). A biotecnologia do DNA nos permitiu realizar uma identificação genotípica de animais portadores do alelo mutante no Uruguai. Eliminá-los ou a realizar cruzamentos

Tabela 1 – Genotipado para a enfermidade BLAD dos 100 melhores touros da Associação de Gado da raça Holandesa dos Estados Unidos onde se observa a diminuição de toros portadores a partir do ano 1991. (http:// http://www.holsteinusa.com/internattop100.html).

a: Touros com genótipo homozigoto dominante (normais), b: Touros com genótipo heterozigoto (portadores), x Dados não apontados pela Associação de Gado da raça Holandesa dos Estados Unidos

S. LLAMBÍ, K. GUEVARA, G. RINCÓN, R. ZAFFARONI, E. DE TORRES, J. BARRERA, M. V. ARRUGA, V. RODRÍGUEZ, A. POSTIGLIONI. Freqüência da deficiência na adesão leucocitária em uma população de bovinos da raça Holandesa, no Uruguai. / Frequency of leukocyte adhesion deficiency in a population of holstein-friesian cattle in Uruguay. Ars Veterinaria, Jaboticabal, SP, Vol. 19, nº 1, 052-056, 2003.

Ano Mês Nº de touros com              Nº de touros com                    Nº de touros     Genótipo Genótipo        sem genotipar        TL/TLa                                  TL/BLb

1991 Dezembro       x    11  x 1994  Janeiro       x    13  x 1997 Novembro     77      9 14 1999 Agosto    69      3 28 2000   Maio    48      4 48 2001 Fevereiro         51      2 47

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Tabela 2 – Genotipado para a enfermidade BLAD na amostra da população de bovinos da raça Holandesa no Uruguai, analisada pela técnica de PCR-RFLP.

a: grupo I, fêmeas procedentes de distintos estabelecimentos leiteiros grupo II; touros utilizados nos distintos estabelecimentos leiteiros, b: animais com genótipo homozigoto dominante (normais), c: animais com genótipo heterozigoto (portadores de BLAD), d: animais com genótipo homozigoto recessivo (afetados de BLAD).

Figura 1 – Eletroforese em gel de agarose (3%) corado com brometo de etídio, de amplificações de ADN por PCR para o gene Blad, digeridas com a enzima Taq I. Linha 1, Marcador de peso molecular (100 pb ladder); linhas 2 e 3 animais com padrões de fragmentos de 159, 109 y 50 pb, indicando que são heterozigotos portadores de Blad;  linha 4 animal com padrão de fragmentos de 109 y 50 pb; indicando que corresponde a um homozigoto  dominante normal.

dirigidos permitirá a redução das  perdas econômicas por mortalidade de terneiros e diminuição da produção leiteira em menor tempo e com maior eficiência, especialmente com a implantação de um programa nacional nos centros de inseminação artificial, permitindo controlar em um futuro próximo esta enfermidade hereditária.

AGRADECIMENTOS

À Sra. Iris Hernández, por sua colaboração na preparação dos materiais de laboratório.

ARTIGO RECEBIDO: ABRIL/2002

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